红树林湿地微生物处于高盐、高有机质含量和潮水反复浸没的特殊环境，具有独特的微生物群系。红树林沉积物具有丰富的微生物和基因多样性，特别是碳水化合物代谢、能量代谢和氨基酸代谢的相关基因，这也是新的微生物和基因资源的潜在储藏库。

广西大学蒋承建教授领衔的“亚热带海洋红树林湿地微生物功能”研究团队，针对亚热带北部湾丰富的海洋红树林湿地微生物新资源，利用各类组学技术，构建了相应的湿地微生物种质资源库。发现种质资源库中的Pichia guilliermondiiGXDK6可以分别利用五碳糖、六碳糖为唯一碳源产β-葡萄糖苷酶。进一步揭示了GXDK6在酸碱（pH 2.5~10.0），盐碱（0~12% NaCl，0~18% KCl/MgCl₂）和重金属（Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺和Mn²⁺等）环境下显示出高耐受性能。同时还发现GXDK6可以利用21种单一有机质，并产生丰富的芳香类代谢产物。

为了进一步研究GXDK6发酵产生香气的分子机理，以橙花醇作为代表的新型芳香代谢物，与GXDK6的全基因组数据进行了进一步比较和分析，并进一步阐明了其代谢途径（图1）。橙花醇（Nerol, C₁₀H₁₈O）作为有价值的香料，广泛应用于食品、化妆品和医药产业中。目前化学合成是大规模生产橙花醇的唯一策略，但是化学合成的缺点极大地限制了橙花醇的生产和应用，然而限制环保的生物合成法生产橙花醇的主要技术瓶颈是，缺乏相应的天然产生香气的微生物。橙花醇的来源首先是将糖酵解或柠檬酸循环的上游来源1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸香叶基二磷酸或芳樟醇橙花醇转化为最终的香叶酸或8-氧香叶醛。在此过程中，参与橙花醇合成的蛋白质是香叶基二磷酸酶，单三苯基二磷酸酶和香叶醇异构酶。涉及橙花醇代谢转化的蛋白质是香叶醇8-羟化酶，醇脱氢酶和香叶醇脱氢酶。相关报道在大肠杆菌代谢工程菌中发酵葡萄糖合成橙花醇，积累量为0.053±0.015 mg /L。橙花醇是由tNDPS1基因催化二磷酸异戊烯基（IPP）和磷酸二甲基烯丙酯（DMAPP）形成了神经磷酸二磷酸酯（NPP），然后将橙花醇合成酶基因GmNES共表达以从NPP合成最终产物橙花醇。然而，以葡萄糖为底物发酵时，GXDK6的橙花醇积累约为2.74 mg/L（p <0.05），高于通过大肠杆菌发酵产生的橙花醇，但橙花醇在天然Meyerozyma guilliermondii的生物合成机理尚未被报道。本研究研究表明具有多重耐受性的生香季也蒙毕赤酵母GXDK6在发酵工业中具有巨大的潜在价值（Microbial Cell Factories. 2021, 20: 4）。

图1：M. guilliermondiiGXDK6生物合成橙花醇的机制阐述。

研究团队通过全基因组学，转录组学，代谢组学整合分析揭示了GXDK6的铜耐受机制（图2）。全基因组分析结果显示，9个基因即（CCC2、CTR3、FRE2、GGT、GST、CAT、SOD2、PXMP4和HSP82）与GXDK6铜耐受性相关。转录组学分析结果表明，在铜胁迫下，谷胱甘肽代谢相关基因表达上调，谷胱甘肽含量和谷胱甘肽硫转移酶活性提高，表明细胞中铜的结合和铜解毒能力增强。铜转运蛋白Ctr3抑制铜吸收和Ccc2增强铜泵出细胞，细胞内铜浓度降低。抗氧化酶基因（PXMP4、SOD2和CAT）表达上调，抗氧化酶酶活性也随之提高，降低了铜诱导的活性氧产生、蛋白质羰基化、膜脂过氧化和细胞死亡，从而提高细胞在铜胁迫下的生存率。代谢组学分析结果表明GXDK6在铜胁迫下，能积累大量D-甘露糖，外源添加D-甘露糖实验验证D-甘露糖有利于提高GXDK6铜耐受性。该研究有助于了解M. guilliermondii的铜耐受机制，及将其运用于食品发酵过程中去除铜奠定理论基础（Frontiers in Microbiology. 2021.12: 771878）。

图2：多组学整合分析揭示新型多重胁迫耐受海洋酵母Meyerozyma guilliermondiiGXDK6的铜耐受机制

研究团队采用多组学结合的方法系统揭示了高浓度NaCl胁迫下海洋季也蒙毕赤酵母GXDK6的脂质代谢机制，并测试了GXDK6在脂质代谢转变时对抗生素的敏感性。全基因组、转录组和蛋白组数据发现，与无盐胁迫相比，当GXDK6感知10% NaCl胁迫时，调控细胞出芽的AYR1显著下调2.69倍，其调控的蛋白NADPH-dependent 1-acyldihydroxyacetone phosphate reductase显著下调1.35倍，表明盐胁迫下GXDK6的细胞增殖被削弱。10%NaCl胁迫下GXDK6的OD₆₀₀值下降了64.39%，也验证了这一发现。同时，盐胁迫促使DEGs（如GUT1、GPP1、TDA10）和DEPs（如glycerol kinase、aldehyde dehydrogenase）显著富集在调控甘油代谢的通路（甘油磷脂代谢、甘油脂代谢），使甘油在胞内大量积累，可知甘油贡献于GXDK6的耐盐生存。这与外源添加甘油探究其对盐胁迫下GXDK6生长的验证试验结果一致。此外，我们发现盐胁迫有助于增强氟康唑对真菌的杀伤作用。与不含盐胁迫相比，GXDK6的菌落数在10% NaCl和64 μg/mL氟康唑条件下降低97.70%。表明氟康唑高度选择性干扰真菌的细胞色素P-450的活性，抑制了真菌细胞膜上麦角固醇的生物合成，且感知盐胁迫后，季也蒙毕赤酵母中调控麦角固醇合成的基因（ERG1、ERG5、ERG11、ERG24）和蛋白（如羊毛甾醇14-α脱甲基酶）也显著下调表达，进一步抑制了麦角固醇的合成，从而强化了氟康唑的杀灭作用。该研究为Meyerozyma guilliermondii在盐胁迫下的脂质代谢调控机制提供了新的见解，可为增强氟康唑对真菌的杀灭作用提供了新途径（Frontiers inGenetics. 2022. 12: 798535）。

图3：多组学整合分析揭示新型多重胁迫耐受海洋酵母Meyerozyma guilliermondiiGXDK6的脂代谢作用机制

上述相关研究亚热带农业生物资源保护利用国家重点实验室、广西微生物与酶工程技术研究中心和广西大学生命科学与技术学院为成果第一单位。科学研究得到了广西科学院广西红树林研究中心的直接支持和指导。研究成果得到了国家自然科学基金项目、国家科技部基础自然调查专项调查项目、中央引导地方科技发展资金项目和广西杰出青年基金项目等的直接资助。