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基础分子生物学实验 教学大纲

发布时间:2017年03月16日 19:15 

基础分子生物学实验 教学大纲

授课专业:生物技术

学时:30

学分:1.5

一、课程性质和目的

本实验课程是一门专业实验技术课,本实验课在本专业人才培养中起着及其重要的地位和作用,它是培养学生今后从事教学科研及技术开发工作最重要的教学实验环节之一,本课程具有知识面宽、实验性强、精密仪器使用多之特点,其目的是使本科生在参加工作和进入攻读硕士之前,对已学课程尤其是现代实验技术手段从理论上有更深的理解,对染色体DNA的提取、琼脂糖凝胶电泳检测DNA、质粒DNA的提取和酶切、PCR基因扩增、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化和DNA重组、基因转化及蛋白表达和纯化等方面以及大型精密仪器的操作使用有进一步了解和掌握,提高学生的动手能力,为其今后从事教学、科研工作打下坚实的理论基础和实际操作能力。

针对学生的培养方向,根据学生具备的专业基础知识和具体的实验操作技能情况,本课程开设了分子生物学综合性探究性的实验内容,利用学院现有的实验条件,培养学生掌握分子生物学实验设计的思路和操作技能,使学生通过本课程的学习和实践,接触和掌握从事生物技术研究所必要的实验手段。通过有限的实验室实践,涵盖分子生物学各个方面的实验内容,以点带面,突出重点,促进学生对分子生物学课程学习内容的理解和掌握。

二、课程教学内容

实验一:水稻染色体DNA的提取和纯度鉴定

基本内容:采用CTAB法裂解细胞膜,使脱氧核糖核蛋白复合物(DNP)解聚,并用苯酚抽提法去除蛋白,从而提取染色体DNA。并对其纯度进行鉴定

基本要求:掌握提取真核细胞染色体DNA的一种基本方法,学习使用紫外线分光法评估DNA的含量和纯度

基本仪器设备:台式高速离心机、塑料离心管、紫外可见分光光度计

基本耗材:CTAB抽提液、95%乙醇、氯仿-异戊醇、70%乙醇、TE缓冲液

实验二:PCR基因扩增及产物回收

基本内容:利用PCR技术扩增基因,并用电泳检测、回收扩增结果。

基本要求:通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术、试剂盒回收PCR扩增产物的技术。

基本仪器设备:PCR热循环仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统

基本耗材:DNA模板、4种dNTP、引物1、引物2、Taq酶、琼脂糖、DNA相对分子质量标准物、10×缓冲液(500mmol/l KCl、100mmol/l Tris?HCl、15mmol/l MgCl2、0.1% 明胶)、吸头、小指管

实验三:DEP1基因的克隆(一)

基本内容:PCR扩增产物的酶切、连接到相应的质粒上并转化感受态细胞;制备质粒DNA,进行DNA重组,鉴定重组子。

基本要求:通过本实验学会重组DNA连接、质粒提取以及鉴定重组子的方法。

基本仪器设备:恒温摇床、恒温水浴器、恒温培养箱、台式离心机、低温离心机

基本耗材:胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、氨苄青霉素、氯化钙、二甲基甲酰胺、Eco RI酶、T4 DNA连接酶、DH5α、pMD18T质粒、培养皿、接种针、玻璃涂棒、试管、酒精灯、镊子、牙签等、3mol/l KAc(pH5.2)、X-gal

实验四:DEP1基因的克隆(二)

基本内容:培养细菌,利用碱裂解法提取质粒,并用限制性内切酶酶解DNA,进行琼脂糖电泳;基因原核表达载体的构建。

基本要求:通过本部分实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。学习运用琼脂糖电泳检测DNA的方法和技术,初步了解限制性内切酶酶解DNA的方法。原核表达载体的构建方法。

基本仪器设备:恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外透射反射仪

基本耗材:葡萄糖、 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸、氢氧化钠、乙酸钾、冰乙酸、氯仿、乙醇、SDS、胰RNA酶、氨苄青霉素、蔗糖、溴酚蓝、酚、8-羟基喹啉、β巯基乙醇、盐酸、含质粒的大肠杆菌、内切酶、溴化乙锭、 DNA marker、硼酸、HindⅢ酶

实验五:DEP1基因的原核表达及其蛋白的纯化鉴定

基本内容: 基因原核表达。细菌蛋白的提取与纯化;蛋白电泳PAGE及Western Blotting。

基本要求:通过本实验学习蛋白的提取纯化方法以及分析鉴定方法。

基本仪器设备:PAGE电泳系统、Western Blotting设备

基本耗材:三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、PAGE、protein marker、检测样品、Coomassie Brilliant Blue、加样缓冲液、anti-His抗体、二抗

实验六:利用PCR技术扩增GFP基因

基本内容:利用PCR技术扩增GFP基因,并用电泳检测、回收扩增结果。

基本要求:通过本实验学习设计引物的基本原理,PCR反应的实验关键因素、试剂盒回收PCR扩增产物的技术。

基本仪器设备:PCR热循环仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统

基本耗材:DNA模板、4种dNTP、引物1、引物2、Taq酶、琼脂糖、DNA相对分子质量标准物、10×缓冲液(500mmol/l KCl、100mmol/l Tris?HCl、15mmol/l MgCl2、0.1% 明胶)、吸头、小指管

实验七: GFP基因重组与鉴定

基本内容:将PCR产物酶切后连接到表达质粒pET28a上,并转化感受态细胞,利用菌落PCR及酶切鉴定重组质粒。

基本要求:通过本实验学会重组DNA连接、质粒提取以及鉴定重组子的方法。

基本仪器设备:恒温摇床、恒温水浴器、恒温培养箱、台式离心机、低温离心机

基本耗材:胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、氨苄青霉素、氯化钙、二甲基甲酰胺、Eco RI酶、T4 DNA连接酶、DH5α、pMD18T质粒、培养皿、接种针、玻璃涂棒、试管、酒精灯、镊子、牙签等。

实验八: GFP基因在原核生物中的表达及检测

基本内容:将重组质粒转化至表达宿主,用IPTG诱导GFP蛋白的表达,通过SDS-PAGE检测蛋白表达,用紫外光检测GFP发光的情况。

基本要求:通过本实验学会蛋白诱导及检测的实验技术。

基本仪器设备:PAGE电泳系统、摇床、紫外光

基本耗材:三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、PAGE、protein marker、检测样品、Coomassie Brilliant Blue、加样缓冲液、IPTG。

实验九: 酵母双杂交感受态的制备

基本内容:活化酵母菌,扩大培养,制备酵母感受态细胞。

基本要求:通过本实验学会制备酵母感受态的实验技术。

基本仪器设备:培养箱、摇床、低温离心机

基本耗材:YPD培养基、Tris-HCl缓冲液、LiSORB、Salmon DNA。

实验十: 酵母双杂交系统研究蛋白质相互作用

基本内容:提取质粒,转化至酵母细胞,涂布于筛选培养基。

基本要求:通过本实验学会酵母转化及鉴定相互作用的实验技术。

基本仪器设备:培养箱、摇床、低温离心机

基本耗材:YPD培养基、PEG/LiOAc、LiSORB、Sorbitol溶液、SD/glucose plate。

三、课程教学基本要求

《基础分子生物学实验》课程的设立为系统培养学生在分子生物学领域基本技术和技能,通过学生的独立实验设计和实践,培养学生的创新思维和独立分析问题、解决问题的能力。

本课程实验技术原理采取以学生自习为主,课堂进行提要式的提示讲解和必要的答疑的方式,使学生掌握实验方法的基本原理和应用范围。本课程强调实验技能训练的重要性,主要课时安排学生实验,以便尽量提高学时利用率。为了节省基础设施投资,提高仪器利用率,本课程采取开放式集中实验的方式,要求学生在实施实验之前,必须做好预习准备,拟好实验方案,经任课教师认可后,方可进入实验室做实验。

在课程成绩评定上,强调平时和考试并重,基础理论和实验技能相结合的综合评定方式。

四、主要参考书

1《基础分子生物学实验》,北京大学出版社,郝福英等,2010

2《分子生物学实验指导》,高等教育出版社,魏群,第一版,1999

3《生物化学与分子生物学实验技术》,高等教育出版社,杨安钢等,第一版,2010

4《分子生物学实验技术》,北京大学出版社,郝福英,1998年

5《分子克隆实验指南》,科学出版社,萨母布鲁克(Sambrook, J.)著,黄培堂等译,2002

6《现代分子生物学实验技术》,中国协和医科大学出版社,卢圣栋主编,第二版,1999 

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